实验室检查： 

　　淋球菌实验室检查包括涂片。培养检查淋球菌。抗原检测。药敏试验及PPNG测定。基因诊断。

　　(一)涂片检查：

　　取患者尿道分泌物或宫颈分泌物。作革兰氏染色。在多形核白细胞内找到革兰氏阴性

　　双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者。此法阳性率在90%左右。可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多。敏感性和特异性较差。阳性率仅为50-60%。且有假阳性。因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少。阳性率低。因此要取前列腺按摩液。以提高检出率。

　　咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病。因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。

　　(二)培养检查：

　　淋球菌培养是诊断的重要佐证。培养法对症状很轻或无症状的男性。女性病人都是较敏感的方法。只要培养阳性就可确诊。在基因诊断问世以前。培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin(TM)培养基和NewYorkCity(NYC)培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基。均含有抗生素。可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃。70%湿度。含5%-10%CO2(烛缸)环境中培养。24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态。革兰氏染色。氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%。女性80-90%。

　　(三)抗原检测

　　1.固相酶免疫试验(EIA)：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原。在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用。可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。

　　2.直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免

　　疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高。特异性差。加之实验人员的判断水平。故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。

　　(四)基因诊断

　　1.淋球菌的基因探针诊断

　　淋球菌的基因探针诊断。所用的探针有：质粒DNA探针。染色体基因探针和rRNA基因探针。

　　(1)质粒DNA探针

　　①隐蔽质粒DNA探针。淋球菌质粒分为三种：接合性质粒。分子最大。为36kbDNA;耐药性质粒包括两个质粒。DNA长分别为5.6kb和7.1kb;隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中。其它奈瑟菌不含有此质粒。故可用它的序列作为特异DNA探针检测淋球菌。Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌。所用探针为隐蔽质粒。用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测。有124株淋球菌杂交反应阳性。占93%。还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应。对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌。研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中(包括不含该质粒的菌株)。因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本。采用非放射性地高辛标记系统。其敏感性和特异性分别为95%和98%。

　　②耐药性质粒DNA探针

　　淋球菌的抗药质粒可分为：①产青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-内酰胺酶阳性;②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(TRNG)。

　　PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的。该菌中含有编码产青毒酶的基因。该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中。而后者居多。称之为产青毒素酶质粒。质粒有二种。大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针。采用酶化学发光法标记。液相杂交。用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株虽对四环素耐药。但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此。在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

　　(2)染色体探针

　　染色体探针包括已知功能的基因探针。如菌毛DNA探针和paI基因探针。这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用;未知功能的基因探针。这些探针序列与染色体的特定序列互补。但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低。检测灵敏度较低。因此一般用的不多。除非有特殊的研究目的。

　　(3)rRNA基因探针

　　rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针。该探针的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探针的特点是：①可以增加探针检测的灵敏度。rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子;②rRNA具有进化上的保守性;③杂交方法简便。快速;④由于rRNA的含量较高。标本不需增菌。美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACEC。是以rRNA及其基因为检测靶序列。采用放射性标记。在2h内可以完成检测。Peter用这种探针检测395个临床标本。结果灵敏度和特异性分别为92.9%。99.4%。他认为PACEC系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者。这是目前培养难于达到的。

　　2.淋球菌的基因扩增检测

　　上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法。虽然比培养方法在灵敏度。特异性和方便性上有了很大的提高。但其仍有一定的局限性。如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高。PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性。它具有快速。灵敏。特异。简便的优点。可以直接检测临床标本中极微量的病原体。

　　(1)淋球菌DNA的提取

　　①培养菌的DNA提取

　　将培养得到的淋球菌。以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解。裂解液组成为：1MNaCl1MNaOH和1%Sodiumdodecylsulphate。将裂解液混匀后煮沸1min。然后用100μl的1MTrispH7.0中和碱性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次。酚—氯仿抽提一次。然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA。提取的DNA溶于30μl蒸馏水或TE缓冲液中。

　　②临床棉拭子标本的提取

　　将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min。以便将标本尽量溶于溶液中。将棉拭子弃去。悬浮液于2-3000r/min离心5min。吸去上清液。细胞重新溶于100μl1×PCR缓冲液。其中含Tween200.45%,蛋白酶K200μg/ml。细胞悬浮液于50-60℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K,12000r/min离心10min,上清液含DNA模板。

　　(2)PCR引物的设计

　　由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在。同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒。因此很多PCR引物设计在CPPB基因区。

　　靶基因引物序列片段长度(bp)

　　CPPBNG15′GTTTGGCTGGTTGATTCAAG3′633

　　NG25′GCAAGATTTCCGATTTGGCG3′

　　CPPBHO15′GCTACGCATACCCGCGTTGC3′390

　　HO25′CGAAGACCTTCGAGCAGACA3′

　　rRNA引物15′-AGGCTGTTGCCAATATCGGC-3′206

　　引物25′-ACACTCGAGTCACCCAGTTC-3′

　　CPPBGC15′CTTATCGTTTGGCTGGTTGATTC3′435

　　GC25′ACCAAGACCAAAGGTTTGACACTG3′

　　GC35′ATTTTCCAGTGTCAAAC3′241

　　GC45′TATTCAAGCCCTATCTG3